Nat Photonics丨黄小帅/范骏超/施可彬/陈良怡/肖斌开发新超分辨率成像技术，实现活细胞三维高速超分辨率成像
信息来源：黄小帅研究员团队
细胞是生命存在和生命活动的基本单位，荧光显微镜作为细胞生物学的基本工具，其分辨率受到阿贝衍射极限的约束，分辨率约为横向250纳米，轴向600纳米，这限制了对细胞中精细结构的研究。自2000年左右开始，多种超分辨率荧光显微成像技术被陆续发明出来，突破了传统的衍射极限，包括单分子定位显微成像（PALM/STORM）、受激辐射损耗显微成像（STED），结构光照明显微镜（SIM）等，使得科学家们可以更好地研究生物系统的微观结构和功能。在这些技术中，SIM因其较小的光漂白、光毒性以及较快的成像速度，而被广泛用于活细胞成像。陈良怡/黄小帅/范骏超团队深耕超分辨显微技术多年，以“软硬件结合、多维度突破”为研发主线，逐步提升活细胞成像的时空分辨率：2018年，团队提出了Hessian-SIM，指出SIM伪影的多重来源并逐条解决，提高了二维SIM的时间分辨率和长时程成像能力（详见BioArt报道：Nat Biotech | 陈良怡、谭山合作团队发明超灵敏海森结构光超高分辨率显微镜——徐平勇点评）【1】。2020年，团队与北京大学施可彬课题组合作，结合Hessian-SIM与三维光学衍射层析成像技术，提出了超分辨荧光辅助衍射层析显微镜（SR-FACT）（详见BioArt报道：眼见为实 | 陈良怡/施可彬合作实现对细胞内细胞器相互作用过程的高速三维全景成像，揭示细胞器互作全景图和新细胞器）【2】，实现对细胞器相互作用过程的高速三维全景成像，揭示细胞器互作全景图。利用SR-FACT，团队在2023年与西湖大学唐鸿云课题组合作，揭示了“线粒体囊”的动态外排过程（详见BioArt报道：专家点评NCB丨唐鸿云/黄小帅团队发现一种全新的亚细胞结构——“线粒体囊” 及其在精子线粒体数量调控和可育性中的关键作用）【3】。同年，针对三维空间中离焦和背景信号给SIM成像带来的影响，团队开发了定量化结构光照明显微镜背景抑制算法（BF-SIM），实现了活细胞定量高保真超分辨率成像（详见BioArt报道：Nat Commun | 陈良怡团队开发活细胞定量高保真超分辨率方法）【4】。2024年，团队与西湖大学章永登课题组合作，发展了4Pi-SIM超分辨显微镜，进一步提高三维超分辨成像的轴向分辨率，以三维各向同性100 纳米分辨率揭示了不同类型细胞中复杂精细的亚细胞结构的动态过程（详见BioArt报道：Nat Methods丨章永登/黄小帅/范骏超/陈良怡开发4Pi-SIM成像技术实现活细胞双色三维各向同性100纳米分辨率）【5】。本项工作旨在提升三维活细胞超分辨成像的时间分辨率，为这一系列工作的一块重要拼图。
当对活细胞进行三维成像时，三维结构照明显微镜（3D-SIM）将所有维度的空间分辨率提高了一倍，更有助于人们了解细胞器三维结构和动态过程【6,7】。然而，由于需要在轴向上逐层移动样本，每层需采集15帧SIM原始图像，成像一个三维体积（如1.5微米厚度）通常需要花费数秒钟，导致时间分辨率受到极大的限制，也容易引入运动伪影。为了提高三维成像的速度，研究人员陆续开发了各种体成像策略，例如使用图像分割棱镜（ISP）或多焦点衍射光栅等。这些方法通过不同的光学设计在像面端引入光程差，从而实现多平面体成像。将体成像技术和结构光照明结合，科学家们提出了多平面 SIM（图1a）和多焦点 SIM（图1b）等工作，得到了横向上两倍超分辨的层析图像结果【8,9】。但在轴向上受限于未能将频谱分离和拓展，最终轴向分辨率基本与宽场成像相同。因此，发展一种能够对活细胞内的细胞器进行快速、三维超分辨成像的新方法，对推动生物医学领域的基础研究具有极其重要的意义。
2025年3月3日，由北京大学黄小帅课题组/施可彬课题组/陈良怡课题组联合重庆邮电大学范骏超课题组/肖斌课题组合作在Nature Photonics杂志上发表题为Fast, three-dimensional, live-cell super-resolution imaging with multiplane structured illumination microscopy的研究论文。该研究提出的快速三维多平面 SIM （3D-MP-SIM）方法，通过构建出新的正向物理模型，并在此基础上，开发对应的新型光路设计与重建算法，不损失3D-SIM的空间分辨率（横向约120纳米；轴向约300纳米）的同时，3D-MP-SIM将时间分辨率提高了约8倍，更显著减少了动态结构成像中的运动伪影。在对内质网进行高速长时程的成像中，新方法最快可以达到11赫兹的三维体成像速度。这一方法也可拓展应用于双色实验，观察细胞内和细胞间的细胞器在三维空间中快速紧密的互作过程。这些结果都证明了 3D-MP-SIM 在观测亚细胞水平上的动态行为和相互作用的潜力。
3D-MP-SIM利用三光束干涉照明与多平面探测方法，同时获取整个体积内的样本信息。采集到的原始图像频谱（图1c）。然而在传统的3D-SIM的正向模型中，它的轴向超分辨率频谱信息在原始频谱中已经体现在了轴向扩展的OTF中（图1d）。若仅采用3D-SIM利用横向相移分离横向混叠频谱的方法，则无法求解3D-MP-SIM数据中混叠的轴向高频信息。为此，需要在横向相位变化之外引入额外的轴向相移。具体在实验系统中，可以通过搭建光学延迟线（图1e）或0级光相位调制等方式来实现结构光轴向相位的改变。3D-MP-SIM的重构流程与传统SIM相似，包含以下几个关键步骤（图1f）：频谱分离、参数估计、频谱移位和维纳滤波等，其中最重要的步骤在于对轴向拓展的±1阶频谱的处理。为了获得更为稳定的成像结果，3D-MP-SIM采用了两步重建流程：首先利用横向相移分离0阶、±1阶和±2阶的频谱组分，然后使用轴向相移进一步分离±1阶的上下两部分。这种方法增强了3D-MP-SIM在真实生物样本重建时的稳定性和准确性。
图1：3D-MP-SIM原理图，系统光路图和重构流程图。a-d，多平面SIM原理图，多焦点SIM原理图，3D-MP-SIM原理图，3D -SIM原理图。e，3D-MP-SIM 系统光路图。f，3D-MP-SIM重构流程图。
通过上述方法，3D-MP-SIM可以实现与3D-SIM分辨率相当的成像结果。在固定细胞的微管实验中，3D-MP-SIM成像效果与3D-SIM相当（图2a-d）。这证实了3D-MP-SIM三维超分辨能力。更重要的是，3D-MP-SIM时间分辨率的提高有助于减少运动伪影并提高活细胞的动态成像效果。例如，研究团队拍摄了次级内体(图2e-g)，在3D-SIM中，快速运动的次级内体在轴向截面上呈现为拉长的线状结构，显示出明显的运动伪影。而在3D-MP-SIM中，次级内体基本保持了圆状的轮廓结构，运动伪影得到显著抑制。相应的仿真模拟结果也证实了3D-MP-SIM能够有效减少快速移动对象的运动伪影。此外，最快可以使用1毫秒的曝光时间实现11赫兹的三维体成像速度，进而成功观察到管状内质网和片状内质网的快速动态过程（图2h-j）。
图2：3D-MP-SIM分辨率表征和活细胞快速三维超分辨成像。a-d，固定细胞中微管成像。e-g，次级内体动态成像。h-j，内质网动态成像
3D-MP-SIM还可拓展到双色实验，观察细胞器结构在三维空间中快速紧密的相互作用过程。得益于其快速的体成像能力，可以更真实地记录细胞器之间的相互作用。利用双色3D-MP-SIM技术，重建图像展现出线粒体外膜和内膜的清晰动态过程。在轴向交叉剖面上可以观测到线粒体内膜的快速动态变化，并在另一区域捕捉到线粒体纳米管与其他线粒体进行交流互动的快速动态过程（图3a-c）。此外，研究团队在活细胞中同时标记了线粒体和内质网，观察到诸如管状内质网延伸穿过线粒体外膜凹陷的中心孔，以及内质网缠绕线粒体等丰富而快速的动态互作过程（图3d-g）。
图3：3D-MP-SIM用于双色成像。a-c，线粒体内膜和外膜动态成像。d-g，线粒体和内质网动态成像。
此外，为进一步提升轴向成像厚度，研究团队进一步结合样本的轴向扫描和多层同步成像，在轴向扫描步进满足一定条件的情况下，3D-MP-SIM采集到的多个原始数据可以拼接为连续整体，运用同样的理论方法重构。这意味着该方法理论上可以拍摄任意厚度的样本，我们通过两次扫描，拼接得到了4.26微米厚的样本，实现了全细胞厚度的三维超分辨率成像（图4a-f）。
图4：3D-MP-SIM用于全细胞厚度成像。a-c，全细胞微管成像。d-f，全细胞线粒体成像。
综上所述，3D-MP-SIM代表了活细胞三维超分辨显微成像领域的重要进展。自2008年Mats Gustafsson博士开发出3D-SIM【7】，以及2011年 Mats Gustafsson课题组的邵林博士开发出基于空间光调制器的活细胞3D-SIM以来【6】，3D-MP-SIM首次将3D-SIM的时间分辨率大幅提升并保持其空间分辨率不变，为活细胞超分辨率成像领域带来了重要突破。其在阐明纳米尺度的亚细胞动态行为方面展现出巨大潜力，为生命科学研究提供了强有力的工具。
北京大学黄小帅研究员、施可彬教授、陈良怡教授和重庆邮电大学范骏超副教授、肖斌教授为该论文共同通讯作者，北京大学博士生陈骞、苟文和北京大学肿瘤医院科研助理路雯清为该论文共同第一作者。黄小帅课题组博士生魏宇弘、李昊宇，硕士生王程玉和科研助理李杰为本工作做出了重要贡献。此外，该工作还得到了北京大学第三医院李正迁课题组、重庆邮电大学毕秀丽课题组、西湖大学章永登课题组、北京大学未来技术学院陈知行课题组和刘贝课题组的重要支持和帮助。
参考文献：
1. Huang, X., et al., Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nature Biotechnology, 2018. 36(5): p. 451-459.
2. Dong, D., et al., Super-resolution fluorescence-assisted diffraction computational tomography reveals the three-dimensional landscape of the cellular organelle interactome. Light: Science & Applications, 2020. 9(1): p. 11.
3. Liu, P., et al., Mitopherogenesis, a form of mitochondria-specific ectocytosis, regulates sperm mitochondrial quantity and fertility. Nature Cell Biology, 2023. 25(11): p. 1625-1636.
4. Mo, Y., et al., Quantitative structured illumination microscopy via a physical model-based background filtering algorithm reveals actin dynamics. Nature Communications, 2023. 14(1): p. 3089.
5. Ouyang, Z., et al., Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100-nm resolution with 4Pi-SIM. Nature Methods, 2025. 22(2): p. 335-347.
6. Shao, L., et al., Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nature Methods, 2011. 8(12): p. 1044-1046.
7. Gustafsson, M.G.L., et al., Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal, 2008. 94(12): p. 4957-4970.
8. Descloux, A., et al., High-speed multiplane structured illumination microscopy of living cells using an image-splitting prism. Nanophotonics, 2020. 9(1): p. 143-148.
9. Senftleben, M.L., et al., Fast volumetric multifocus structured illumination microscopy of subcellular dynamics in living cells. Biomed Opt Express, 2024. 15(4): p. 2281-2292.